甲基化檢測技術(shù)

一、甲基化檢測

甲基化檢測主要分為兩大類，第一類非轉(zhuǎn)化法，有甲基化特異限制性酶切法和免疫共沉淀法。第二類是轉(zhuǎn)化法，有亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法和酶轉(zhuǎn)化法。

1.甲基化特異限制性酶切法

利用甲基化敏感性內(nèi)切酶（如HpaⅡ）無法切割甲基化CpG位點(diǎn)的特性，通過酶切片段大小判斷甲基化狀態(tài)。低成本，簡便操作，適合快篩已知位點(diǎn)。局限：特定序列依賴，難辨部分甲基化，有假陽性風(fēng)險(xiǎn)，不適合混樣。

2.免疫共沉淀法

用5-甲基胞嘧啶抗體富集甲基化DNA片段，結(jié)合測序（MeDIP-seq）分析。全基因組覆蓋，無需預(yù)知甲基化位點(diǎn)，但分辨率低，抗體特異性要求高，對低甲基化區(qū)域不敏感。

3.亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法

亞硫酸鹽處理使未甲基化C→U，多重PCR靶向富集目標(biāo)區(qū)域，高通量測序定量單堿基甲基化水平。高靈敏度檢測甲基化，質(zhì)控嚴(yán)格，亞硫酸鹽處理或致DNA降解需優(yōu)化。

4.酶轉(zhuǎn)化法

酶轉(zhuǎn)化法通過特定的酶反應(yīng)將甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，避免了亞硫酸鹽處理的化學(xué)步驟，提供了一種更為直接和可能更精確的甲基化檢測手段。優(yōu)點(diǎn)是模板損傷少，甚至可區(qū)分出羥甲基胞嘧啶，但轉(zhuǎn)化效率不全、有序列偏好性，樣本需求量大，商業(yè)化試劑盒昂貴，流程不成熟。

二、轉(zhuǎn)化后甲基化檢測方法

轉(zhuǎn)化后甲基化檢測方法多樣，例舉幾種常用方法。

1.焦磷酸測序測序峰圖清晰，只需要低模板起始量，但有效讀長只有60bp，無法獲取周圍CpG島信息。

2.克隆測序確定CpG甲基化頻率，500-800bp，每個(gè)位點(diǎn)需測序8-10次，但統(tǒng)計(jì)誤差較大，重復(fù)性差（與克隆數(shù)有關(guān)），操作繁瑣不宜大批量。

3.Hi-MethylSeq，翼和生物運(yùn)用亞硫酸氫鹽處理與多重PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)區(qū)間甲基化位點(diǎn)的精確定量分析，一次測序反應(yīng)每個(gè)位點(diǎn)測序長度在150-200bp，深度一般為一千倍以上。

4.qPCR法通過特定的引物探針或染料檢測序列，實(shí)驗(yàn)流程快速便捷，定量準(zhǔn)確，但針對固定的檢測位點(diǎn)，覆蓋范圍有限，分辨率低，依賴引物/探針設(shè)計(jì)，通量受限。